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负染色法(Negative stain)是一种染色方法，常用于不透光液体标本的镜检。由于其染色处理过程并非针对菌体本身，故又称“衬托染色法”、“间接染色法”。在负染色法中，标本不需要热固定，细胞不会因为化学药物的影响而变形，对于不易染色的细菌或病毒也能观察。

负染色是一种容易，快速，定性的方法，常用于检查分离的细胞器，大分子和病毒在EM水平的结构。但是，该方法不能够对样品进行高分辨率检测 - 这在技术上更为复杂的快速冷冻。另外，因为负染色涉及沉积重原子，容易造成结构假象，球形或圆柱形结构的假象是非常常见的。然而，负染非常有用，不需要过于昂贵的技术。

样品应悬浮在合适的缓冲液(如10 mM HEPES或PIPES)中，1%乙酸铵或蒸馏水中。 最好不要使用磷酸盐缓冲液或PBS，因为它们可能会污染网格，否则会导致染色后必须清洗的盐残留物，造成衬度的损失。 尤其是，铀酰盐与磷酸根离子发生反应，产生细微的结晶沉淀，使沉淀物变得模糊。 [铀离子的沉淀磷酸根离子也是在使用TEM的样品处理过程中使用乙酸铀酰作的潜在问题。】

MRC实验室Protocol：

所需材料

5%乙酸铀酯在二水合物中

碳涂层电镀网格

自锁/锁定镊子

100ul PCR管

发光放电器

清洁玻璃片和培养皿

Whatman纸，石蜡膜

相同缓冲液中的蛋白质和脂质体

准备蛋白质，缓冲液，管和网格。将网格放置在清洁的显微镜载玻片上。在实验室工作台上贴下干净的石蜡膜;将任何一面浸湿纸(尽量减少干燥)。

在PCR管中混合蛋白质和脂质。总体积将取决于您必须使用多少蛋白质。通常我混合至少20 ul;否则蒸发会大大改变盐含量。

辉光放电：在真空室内放置带有栅格的顶部(碳朝上)，并拉动真空和辉光放电。如果不使用自动定时器，辉光放电30-60秒。排空后，将其置于培养皿中并返回实验室。如果没有可用的发光放电器，则可以省略此步骤。然而，结果不会那么干净(较少的蛋白质会绑定，也可能更多地在网格上)。

将UrAc(每次20-40μl)滴入Parafilm - 每个样品两滴。在染色方案中，有一块(折叠)Whatman纸用于吸收多余的污渍和洗涤网格缓冲液。还有另一块Whatman，标有贴在其上的染色网格。

在夹钳中握住网格。将6ul蛋白质/脂质溶液移至网格上。 20-45秒后，将缓冲液蛋白溶液印迹到Whatman纸上，接触第一次UrAc滴，立即去除多余的污渍，接触第二次UrAc滴。等待10-30秒，然后去除UrAc(注意吸除镊子中残留的液体)。然后可以通过接触一滴缓冲液来清洗网格，并将其过量吸收。将网格放在标签的Whatman纸上

允许网格干燥几分钟，然后放在网格框(注释位置/ ID在实验室书)。网格可以立即可视化，通常可以稳定数月或数年。

背景/评论

负染是一种非常快速，简便的方法，可视化蛋白质，脂质，DNA - 任何大分子复合物。对于较大的蛋白质，复合物或连续寡聚体(例如肽或淀粉样蛋白纤维，尽管单个亚基非常小，可以容易地可视化)是有用的。理论上最大分辨率的负染色为7A 这几乎和cryo-EM一样好，而且要容易得多。更典型的分辨率是15-30A通常有可能可视化数百kD的复合物(NB：简单的计算和经验表明，不可能看到单独的蛋白质，或者在我手中，GroEL 14mers(840kD)或网格蛋白三糖(600kD)小于200kD的复合物，可以在良好的网格上制作，但HSP60单体不能)。然而，负染色的主要缺点是蛋白质固定在低pH，高离子强度的乳液或铀离子层中。这并不一定会对所有的蛋白质产生重大的瑕疵(对于那些已经被cryoEM和负染所观察到的那些蛋白质，几乎没有假象)，但是基本上对蛋白质的影响是未知的。脂质体或脂质管倾向于塌陷，可能来自干燥期间的高离子强度。

UrAc的替代染色剂是磷酸钨酸或PTA。这可以在diH2O中达到2%，然后pH值达到7.PTA的优点是pH值更为生理，对于某些事物，分辨率可能更大;缺点是对比度较低，我经常遇到大染色水晶的问题，因此很难找到网格的染色区域。但它是一个很好的控制。如果结构在PTA和UrAc两者中看起来相同，那么它们不太可能是染色伪像。

操作方法：

滴染法：一般现将样品用拉长的毛细吸管一滴在被膜的载网上，用滤纸在载网上吸去多余的样品，使样品在载网上仅有一层水膜而无液滴存在。在水膜未干时，再加一滴复染液在铜网上，然后用滤纸靠在载网变上吸去多余的染液，这是常规的负染方法。由于病毒在液滴的边缘分布较多，上诉方法可能造成较多的病毒丢失，改良的方法是用毛细管在载网中部加1-1.5mm直径的一小滴病毒悬液。不用滤纸吸干而任其在自然状态下稍干后加入一小滴染液，也不用滤纸吸干，令其自然赶走。染液的密度取决于液滴的量和它的浓度，应经试验确定，此法对于一些浓度低的病毒样品可能获得较好的效果。

漂浮法：现将需负染的样品滴几滴在干净的载玻片上，再将有支持膜的载网漂浮在样品液滴上以沾取样品，用滤纸吸干样品余液使样品在载网上仅有一薄层液膜，在样品未干时即加一滴复染液的铜网上，用滤纸吸干多余的染液即可。也可在磷钨酸染液液滴中加入少许提纯的病毒混匀，讲有膜的铜网漂浮在液面上沾取有病毒的染液，用滤纸靠在铜网吸干。

喷雾法：将样品与染液混合，用特制的喷雾器将混合液喷洒在有膜的载网上。这种方法的优点是样品在载网上的分布十分均匀，但需要特殊的设备，故较少采用。而且染液和样品消耗量较大，又易造成病毒的扩散。

负染的时机十分重要，一般不应再载网上的样品完全干了之后，也不应该在载网上尚有肉眼可见的水珠时着手染色。应该在用滤纸吸干载网上的样品液滴，肉眼看不见残液，又未干燥时滴加染液。

提纯的病毒在负染时最好进行1:10-1:100倍的稀释，炫富病毒的缓冲液应尽可能稀一些，叫弄的缓冲液会使载网上产生许多盐类的结晶而影响图像的质量。缓冲液较浓时，宜先用双争辉稀释。

复燃用的载网支持膜(有时是碳膜)，有时因疏水性的影响沾样后会形成一个球形液珠，用滤纸一吸即全部吸光，样品难以附着在支持膜上，遇到这种情况，需要离子溅射仪对载网进行沁水处理，改善支持膜的亲水性

复燃中常遇到颗粒悬滴样品的凝集现象，即生物样品与染色剂形成电子致密的团块，致使无法观察超微结构。这种现象是由多种因素引起的，除了上诉支持膜疏水性影响外，还可能是悬液浓度过大，悬液中细胞碎片过多，悬液PH值不适等，可以通过对样品稀释，惊醒2000-5000rpm离心和调节悬液PH值到中兴或偏酸性来解决。

悬液颗粒分散性差也可以用分散剂来加以解决

用0.005-0.05%牛血清白蛋白(BSA)加入提纯的病毒中，加入量无严格规定，一般0.5ml样品中加3-4滴即可，如效果不好可适当怎额增加，也可直接用0.01%BSA作为离心沉淀物的悬浮液。

将杆菌肽粉末按30-50ug/ml的浓度用蒸馏水配成溶液，用来稀释离心沉淀的颗粒标本或按适当比例加到需负染的样品中取，也可以按样品，磷钨酸和杆菌肽等量混合在滴到载网上，吸干即可观察。

除上诉两种分散剂外，还有人采用甘油丙二醇作为分散剂，也有人用1%二甲基亚砜(DMSO)加到染液里加强染液的穿透力和扩散作用，最近有人用十八(碳)烷的单分子层作为湿润剂，使不易染色的某些生物大恩自以着色。

某些病毒对复染色液较为敏感，负染色液会破坏形态结构，遇到这种情况，除改用其它种类的复染色液之外，还可在负染先用1%的戊二醛按比例与样品悬液混合，固定15分钟。或者在沾样后，将载网票在0.1%的戊二醛液滴上进行固定。也可以用四氧化e整齐xun蒸固定然后在做负染。

滴样后用双蒸水进行适当清洗，可以有效地改善负染效果。尤其是使用醋酸铀做负染色液时，应尽量洗掉样品中的缓冲液盐、组织汁液等，以免与负染液反应产生沉淀。经固定后的样品必须经过清晰，对直接取自蔗糖密度梯度或氯化铯密度梯度离心沉淀带的炫富样品，沾取后双蒸水适当清洗后，就可直接负染观察。

观察负染色的生物样品时，电镜应使用最小的武警光澜，以增大反差。加速电压可稍高一些，也增加电子的穿透能力。尽量避免电子束的长时间照射，一般在 3-4万倍的放大倍率下照像，均可获得高分辨率的电镜图像。